1 Щелкунова Є.І. 1 Воропаєва А.А. 1 Русова Т.В. 1 Баіт В.С. 1
1 ФГБУ «ННІІТО ім. Я.Л. Цив'яна »МОЗ Росії
Методами іммуноцітохіміі і флуоресцентної мікроскопії досліджували синтетичну активність хондроцитів, виділених з хряща різних топографічних зон колінного суглоба хворих на гонартроз III-IV ступеня, що розрізняються виразністю дегенеративних змін. На 7-му добу культивування визначали активність синтезу хондроцитами аггрекана і колагену 2-го типу по інтенсивності світіння Alexa Fluor 488. Найбільш інтенсивно агрекан синтезували клітини з ненавантажуваних зони (відповідає задньому краю внутрішнього виростка стегнової кістки) у порівнянні з хондроцітамі з інших зон. Хондроцити малонагружаемой (відповідає латерального виростка великогомілкової кістки) і навантажується зони (відповідає медіального виростка великогомілкової кістки) демонструють знижену активність синтезу аггрекана. При візуальній оцінці синтезу колагену II типу показано, що найбільш інтенсивно даний білок синтезується хондроцитами навантажується і малонагружаемой зон. Неоднакова синтетична активність хондроцитів щодо аггрекана і колагену 2-го типу може бути наслідком змін їх метаболізму в зв'язку з особливостями розвитку патологічного процесу в суглобовому хрящі різних топографічних зон колінного суглоба хворих на гонартроз.
флуоресцентна мікроскопія
іммуноцітохіміі
колаген ii типу
аггрекан
суглобовий хрящ
гонартроз
1. Божокін М.С., Божкова С.А., Нетилько Г.І. Можливості сучасних клітинних технологій для відновлення пошкодженого суглобового хряща // Травматологія і ортопедія Росії. - 2016. - №22 (3). - С.122- 134.
2. Зміни експресії mn-супероксиддисмутази в гіппокампекрис під впливом одно- і триразовою помірною гипобарической гіпоксії / С.А. Строєв, Є.І. Тюлькова, М.О. Самойлов, М.Т. Пелта-Хьюкко // Морфологія. - 2011. - С. 7-12.
3. Клітинні технології і тканинна інженерія в лікуванні дефектів суглобової поверхні / М.М. Радників, В.А. Кальсін, М.А. Конопляник, В.В. Муханов // Клінічна практика. - 2013. - №1. - С. 52-66.
4. Особливості метаболізму протеогліканів з різних топографічних зон колінного суглоба у хворих на остеоартроз: варіабельність фенотипу хондроцитов / Т.В. Русова, Е.Л. Строкова, А.А. Воропаєва, Є.І. Щелкунова // Сибірський науковий медичний журнал. - Т. 33, №5. - 2013. - С. 78-86.
5. Русова Т.В., Баіт В.С. Структура гликозаминогликанов суглобового хряща у хворих на остеоартроз: вплив топографії колінного суглоба // Сибірський науковий медичний журнал. - Т. 32, №2. - 2012. - С. 54-60.
6. Структурно-функціональні особливості хрящової тканини колінного суглоба при остеоартрозі / Т.В. Русова, А.А. Воропаєва, А.В. Корель, Є.І. Щелкунова // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2015. - №5. - С. 337.
7. Anderson AS, Loeser RF Why is osteoarthritis an age-related disease? // Best. Pract. Res. Clin. Rheumatol. - 2010. - Vol. 24, No 1. - P. 15-25.
8. In vitro human chondrocyte culture; A modified protocol Middle-East / M. Heidari, M. Tahmasebi, S. Etemad et al. // J. Scient. Res. - 2011. - Vol. 9 (1). - P. 102-109.
9. Mid-term results of autologus matrix-induced chondrogenesis for treatment of focal cartilage defects in the knee. / J. Gille, E. Schuseil, J. Wimmer et al. // Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. - 2010. - Vol. 18 (11). - P. 1456-1465.
10. Kwon HJ, Ohmiya Y. Metabolomic analysis of differential changes in metabolites during ATP oscillations in chondrogenesis // Biomed. Res. Int.- 2013. Article ID 213972, 8 р.
Гонартроз - поширене захворювання колінних суглобів, дегенеративного характеру, яке зачіпає всі компоненти суглоба, пов'язане з локальною втратою хрящової тканини з плином часу. В даний час вважається, що руйнування суглобного хряща при остеоартрозі є результатом надмірного навантаження, вікових змін і порушення обміну речовин [4, 7]. При розвитку гонартроза часто виникає варусна деформація, яка тягне за собою перерозподіл біомеханічної навантаження на суглобові поверхні з її збільшенням на хрящову тканину в області медіального виростка великогомілкової кістки. В результаті в колінному суглобі виникають зони з різним ступенем дегенерації хрящової тканини. За ступенем біомеханічної навантаження, відповідного ступеня дегенерації хряща, їх умовно можна назвати ненавантажуваних (задній край внутрішнього виростка стегна), малонагружаемая (латеральний мищелок великої гомілкової кістки) і навантажується зони - найбільш змінений хрящ (відповідає медіального виростка великогомілкової кістки) [5, 4 ].
Здібності гиалинового хряща до регенерації дуже обмежені і пошук методів відновлення суглобових поверхонь є актуальною і невирішеною завданням [1, 3]. В останнє десятиліття активно розробляються клітинні методи відновлення гіалінового хряща, в тому числі, аутологічної трансплантація хондроцитов (ХЦ) [1]. Як джерело ХЦ може бути використаний суглобовий хрящ ненавантажуваних зони. У літературі представлений ряд застосовуваних клітинних продуктів на основі аутологічних ХЦ ненавантажуваних суглобового хряща, отриманих методом артроскопії [1,8,9]. Для заміщення хрящового дефекту, потрібна достатня кількість ХЦ, що зберегли свій хондрогенний фенотип, здатних вижити в середовищі суглоба, ураженого патологічним процесом. При цьому для формування гиалинового хряща в області дефекту хрящової тканини трансплантовані клітини повинні синтезувати необхідну кількість ключових компонентів позаклітинного матриксу, таких як колаген II типу і агрекан [1], з тим, щоб відкладається ними позаклітинний матрикс мав фізико-хімічними властивостями близькими нативному гіалінових хрящем [3]. Показано, що ХЦ хворих на гонартроз, виділені з зон колінного суглоба з різним ступенем дегенерації хряща мають неоднаковий фенотип. Це проявляється в зниженні експресії генів колагену II типу, версікана і KLF4 хондроцітамі, виділеними з найбільш зруйнованої зони колінного суглоба у хворих на гонартроз - медіального виростка великогомілкової кістки [4]. Також встановлено, що в різних топографічних зонах колінного суглоба хворих на гонартроз в залежності від ступеня дегенерації хряща колаген і протеоглікани істотно розрізняються за кількістю, якістю, характеристиками зв'язків з іншими компонентами матриксу [6], що вказує на перебудову метаболізму хондроцитів під дією патологічного процесу. Неясно, чи є зміни метаболічного фенотипу ХЦ незворотними, а також не визначено, яким чином впливає уніфікація умов функціонування в культурі на фенотипічні риси клітин, отриманих з різних зон колінного суглоба, що розрізняються за ступенем дегенерації хряща.
Мета дослідження: порівняльний аналіз синтезу основних компонентів матриксу хряща - агрекана і колагену II типу хондроцітамі in vitro, виділених із зон колінного суглоба, що розрізняються за ступенем дегенерації хрящової тканини.
Матеріал і методи дослідження
Досліджували хрящову тканину різних топографічних зон колінного суглоба хворих посттравматичним гонартрозом III ступеня з варусной деформацією (5 пацієнтів у віці від 60 до 75 років) після резекції суглоба в ході операції ендопротезування. До групи дослідження входили 2 чоловіків і 3 жінки. У всіх пацієнтів не було виявлено інфекційних, онкологічних і психічних захворювань, вроджених і спадкових патологій, а так само цукрового діабету, остеопорозу та інших захворювань провоспалительного характеру. Всі пацієнти підписали добровільну інформовану згоду на використання їх біоматеріалу для наукових досліджень.
Подрібнену і промиту 0,9% NaCl тканину ціалізуватися 0,2% розчином колагенази II типу ( «Gibco», США) протягом 18 годин при 37 ° С. Виділені клітини відмивали PBS і ресуспензіровалі в DMEM / F12 ( «Біолот», Росія), що містить 15% FBS ( «Gibco», США) 42.19 од. / Мл пеніциліну, 0.042 мг / мл стрептоміцину ( «Біолот», Росія), 0.053 мг / л амфотерицину в ( «Biowest», Франція) в кінцевих концентраціях. Клітини культивували в 12-ямковий планшетах ( «TPP», Швейцарія) при 37 ° С, в атмосфері 5% СО2, в концентрації 23 000 клітин на 1 см².
Оцінку синтезу колагену II типу і агрекана ХЦ різних топографічних зон проводили методом іммуноцітохіміі. Планшети з клітинами виводили з експерименту на 7-му добу культивування. Клітини промивали PBS і фіксували розчином 4% формаліну в фосфатному буфері, через 10 хв. проводили пермеблілізацію мембран 4% розчином Triton X-100 (v / v) в 4% формаліні (v / v). Потім препарати інкубували в 1% розчині BSA (w / v) (Sigma, США) протягом 30 хв., Після чого протягом 19 год інкубували з первинними поліклональними мишачими антитілами до агрекану ( «Abcam», США) і кролячими антитілами до колагену II типу ( «Abcam», США) [2]. Через 20 год препарати промивали PBS і фарбували вторинними мишачий антитілами, кон'югованими з Alexa Fluor 488 (Invitogene, США) і кролячими антитілами - з Alexa Fluor 568 (Invitogene, США). ДНК маркували DAPI. Спостереження, зйомку препаратів і оцінку інтенсивності світіння виробляли за допомогою мікроскопа Axio Observer Z1 ( «Zeiss», Німеччина) та програми ZEN Pro ( «Zeiss», Німеччина) при збільшенні до 100 разів (10х) і з використанням фільтрів DAPI, Alexa Fluor 488 і Alexa Fluor 568. Спостереження кожного препарату проводили в 5-ти полях зору.
Результати та обговорення
При візуальній оцінці виявлено, що розподіл (Рис. 1а) і інтенсивність (Рис. 1 г) флуоресценції клітинних ядер в поле зору (канал DAPI, блакитний графік) нерівномірні (Рис. 1а). Ядра ХЦ переважно утворюють скупчення, частина з яких настільки щільні, що окремі ядра важко диференціювати. Ділянки високої інтенсивність світіння в каналі DAPI збігається з ділянками високої інтенсивності світіння агрекана в каналі Alexa Fluor 488 (Рис. 1 б, г). Отримані дані вказують на те, що на 7-му добу культивування ХЦ формують досить великі агрегати, що містять агрекан.
Мал. 1. Синтез аггрекана і колагену 2 типу хондроцітамі ненавантажуваних зони
А - ядра хондроцитів, пофарбовані флуоресцентним барвником DAPI
Б - аггрекан, який синтезується хондроцитами, окрашениий Alexa Fluor 488;
В - колаген 2 типу, який синтезується хондроцитами окрашениий Alexa Fluor 568;
Г - Графік нерівномірності інтенсивності флуоресценції в трьох каналах: DAPI, Alexa Fluor 488 і Alexa Fluor 568
Флуоресценція колагену II типу (червоний графік) менш інтенсивна, в порівнянні з флуоресценцією агрекана (зелений графік) (Рис. 1 г), ділянки відкладення колагену II типу не завжди збігаються з агрегатами клітин. В агрегатах клітин колаген II типу розташовується компактно, на поверхні клітинної агрегату. Даний білок добре візуалізується і поруч з клітинами, ядра яких лежать поодиноко (Рис. 1 ст), при цьому колаген розташовується під кліткою і / або навколо клітини, але не на її поверхні. Навколо значно більшого об'єму клітин відкладення колагену II типу не візуалізуються (Рис. 1 ст). Можливо, ХЦ не встигли синтезувати необхідну для візуалізації кількість колагену. З іншого боку, гиаліновий хрящ ненавантажуваних зони колінного суглоба має відносно слабку колагенову мережу при великому вмісті протеогліканів в порівнянні з двома іншими досліджуваними зонами [6], тому не виключено, що у ХЦ з ненавантажуваних зони здатність до зниженому синтезу колагену II типу і більш високому синтезу агрекана детермінована особливостями хрящової тканини, з якої вони були виділені.
Відомо, що колаген II типу і агрекан секретують ХЦ переважно зони ізогенних груп клітин суглобового хряща [3]. Можливо, відсутність відкладень колагену II типу близько частині ХЦ з ненавантажуваних зони пов'язано з присутністю в цій культурі клітин всіх глибинних зон хряща: клітин поверхневої зони, зони колонкових структур і зони гипертрофических клітин, які відрізняються за розмірами, функцій і спектру експрессіруемих маркерів.
Клітинний покрив в культурі ХЦ з малонагружаемой зони (хрящ з латерального виростка великогомілкової кістки) до 7-ї доби більш рідкісний, в порівнянні з культурою ХЦ з ненавантажуваних зони, в поле зору спостерігаються ділянки, де інтенсивність світіння близька до нуля (Рис. 2 а, г). Це свідчить про знижену життєздатність і / або проліферації клітин цієї зони в культурі [6]. Як і в разі ХЦ з ненавантажуваних зони, в культурі ХЦ з малонагружаемой зони відзначається нерівномірність розподілу і інтенсивності флуоресценції клітинних ядер, клітини зібрані в агрегати (Рис. 2 а), але менш щільні, ніж в культурі клітин ненавантажуваних зони (Рис. 1) .
Мал. 2. Синтез аггрекана і колагену 2 типу хондроцітамі малонагружаемой зони
А - ядра хондроцитів, пофарбовані флуоресцентним барвником DAPI
Б - агрекан, який синтезується хондроцитами, окрашениий Alexa Fluor 488;
В - колаген 2 типу, який синтезується хондроцитами окрашениий Alexa Fluor 568;
Г - графік інтенсивності флуоресценції в трьох каналах (DAPI, Alexa Fluor 488 і Alexa Fluor 568.)
Відношення інтенсивності світіння в каналі Alexa Fluor 488 до інтенсивності світіння в каналі DAPI в культурі ХЦ з малонагружаемой зони нижче, в порівнянні з клітинами з ненавантажуваних зони, що свідчить про зниженій кількості синтезованого агрекана в перерахунку на клітку (Рис. 2 г). У культурі клітин з цієї топографічної зони агрекан візуалізується слабо у вигляді дрібних агрегатів і точкових відкладень (Рис. 2 б). Розташування агрегатів агрекана не завжди відповідає розташуванню клітинних ядер хондроцитів. Такий феномен можна пояснити кількома причинами: можливо, що не всі спостережувані клітини синтезують агрекан в кількості, достатній для візуалізації, або клітини мігрують з місць синтезу аггрекана. Крім того можлива локалізація колагену над поверхнею клітин, що маскує світіння агрекана. Очевидно, ХЦ малонагружаемой зони на 1-му тижні культивування не здатні до формування великих агрегатів, що містять агрекан.
Колаген II типу локалізується як в клітинних конгломератах, так і навколо поодиноко розташованих клітин, причому відкладення колагену в навколо-зоні виявляються не у всіх клітин. Колаген II типу розташовується переважно навколо ядра у вигляді півкільця або підкови. У культурі присутні клітини, навколо яких колаген візуалізується точково (Рис. 2 ст). На графіку інтенсивності флуоресценції колагену піки, що відображають характеристики розташування його в культурі, відрізняються по висоті і ширині (Рис. 2 г) (червоний графік), що свідчить про різну кількість і площі відкладень колагену в культурі. На початку графіка і на невеликих ділянках поля зору, інтенсивність флуоресценції колагену близька до нуля. Часто піки колагену не збігаються з піками агрекана, що, можливо, пов'язано зі спеціалізацією синтезу молекул позаклітинного матриксу клітинами в процесі культивування, а також з низькою щільністю культури клітин малонагружаемой зони до даного терміну культивування.
Культура ХЦ з навантажується зони колінного суглоба до 7-ї доби культивування відрізняється зниженою кількістю клітин в порівнянні з культурами клітин, отриманих з інших зон. Судячи за світінням в каналі DAPI, клітини зібрані в менш щільні конгломерати, в порівнянні з ХЦ з ненавантажуваних зони, і в більш щільні - в порівнянні з малонагружаемой зоною (Рис. 3 а). Агрекан (Рис. 3 б) і колаген II типу розташовується поблизу груп клітинних ядер. На графіку інтенсивності флуоресценції (Рис. 3 г) видно, що криві флюоресценції агрекана (зелений), колагену II типу (червоний) і DAPI (блакитний) корелюють, піки інтенсивності світіння практично збігаються за частотою, чого не спостерігалося в культурі ХЦ з інших зон .
Мал. 3. Синтез аггрекана і колагену 2 типу хондроцітамі навантажується зони
А - ядра хондроцитів, пофарбовані флуоресцентним барвником DAPI
Б - аггрекан, який синтезується хондроцитами, пофарбований Alexa Fluor 488;
В - колаген 2 типу, який синтезується хондроцитами пофарбований Alexa Fluor 568;
Г - Графік нерівномірності інтенсивності флуоресценції в трьох каналах (DAPI, Alexa Fluor 488 і Alexa Fluor 568.)
Таким чином, судячи з характеристик культури, ХЦ, отримані з навантажується зони колінного суглоба, менш розрізняються за фенотипом, ніж ХЦ з інших зон. Можливо, це пов'язано з відсутністю та / або скороченням в культурі популяцій ХЦ з поверхневою і середньої зони хряща, оскільки хрящ в області медіального виростка стегнової кістки є найбільш пошкодженим, без ознак поділ на зони. Не виключено, що це може бути наслідком низької проліферативної і міграційної активності клітин.
Відомо, что у ХЦ процеси біосінтезу колагену и протеогліканів відбуваються в протіфазі. Коли енергетичний заряд Клітини високий, Всередині ХЦ переважають UTP-гексози - попередники протеогліканів, в тій годину як при зниженя Енергетичному заряді в ХЦ віявляється Збільшення концентрації попередніків колагену -проліна, гліціну [10]. Зниженя енергетичного заряду Клітини відбувається и внаслідок мітозу [10]. Беручи ЦІ факти до уваги, можна пріпустіті, что ХЦ, отрімані з різніх зон колінного суглобу, з яких причин відрізняються можлівістю Відновлення енергетичного заряду Клітини. Так, ХЦ з самой збереженої зони володілі найбільшою проліфератівною актівністю и найбільшою здатністю сінтезуваті агрекан, что свідчіть про успішне Відновлення енергетичного заряду ХЦ после циклу ділення. У культурах клітин з більш пошкоджених зон колінного суглоба при зниженні відносини інтенсивності флуоресценції агрекан / колаген одночасно спостерігали знижений кількість клітин в культурі. У забезпеченні клітин енергією основну роль грають два метаболічних шляху - дихання і гліколіз. Визначення внеску кожного шляху в забезпечення культивованих ХЦ енергією може сприяти з'ясуванню механізмів, що призводять до різниці фенотипів ХЦ з різних топографічних зон колінного суглоба хворих на гонартроз, а також забезпечити найбільш сприятливі умови культивування даних клітин з точки зору проліферації і синтезу компонентів позаклітинного матриксу.
Висновок
Досліджено синтетичні особливості ХЦ, культивованих протягом 7-ми діб, отриманих із зон колінного суглоба, що розрізняються за ступенем дегенерації хряща у хворих на гонартроз. Показано, що проліферативна активність ХЦ в культурі падає в залежності від вираженості дегенерації хрящової тканини, з якої вони були виділені, від ненавантажуваних до навантажується зоні.
Показано, що агрекан і колаген II типу синтезуються хондроцітамі всіх зон, але в різній кількості. Найбільший потенціал до синтезу агрекана на даному етапі культивування мають клітини ненавантажуваних зони. Висока інтенсивність флуоресценції і наявність агрегатів в культурі клітин свідчить про збереження метаболічної активності хондроцітамі цієї зони в порівнянні з іншими. Знижена здатність до синтезу агрекана клітинами малонагружаемой і навантажується зон може бути наслідком змін метаболізму клітин в процесі розвитку патологічного процесу в суглобовому хрящі.
При візуальній оцінці синтезу колагену II типу ХЦ з різних зон колінного суглоба, що розрізняються за ступенем дегенерації хрящової тканини, показано, що найбільш інтенсивно даний білок синтезують хондроцити навантажується і малонагружаемой зон.
Робота виконана на кошти гранту Президента Російської Федерації для державної підтримки молодих російських учених №МК-6370.2015.7
бібліографічна ПОСИЛАННЯ
Щелкунова Є.І., Воропаєва А.А., Русова Т.В., Баіт В.С. СИНТЕЗ АГРЕКАНА І КОЛАГЕНУ II ТИПУ IN VITRO Хондроцити З РІЗНИХ ЗОН колінного суглоба хворих на гонартроз // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2016. - № 6.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25854 (дата звернення: 23.06.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, что видають у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?
<
